La cytotoxicité des cellules T

Faisons maintenant un peu de biologie cellulaire plus poussée. Nous avons choisis pour cette page moléculaire, de détailler les mécanismes mis en jeu par un LTCD8 différencié pour détruire les cellules du greffon.

 

 

Une fois activées puis différenciées, les cellules TCD8 qui reconnaissent les antigènes présentés par le CMH I du greffon (alloreconnaissance directe)  attaquent  directement les cellules du greffon dans le but de les détruire. Intéressons nous aux mécanismes moléculaires mis en jeu par le LT cytotoxique pour détruire une cellule du greffon.

Les cellules T cytotoxiques appelées CTL (cytotoxic T lymphocytes) induisent l’apoptose de leur cellule cible. On définit l’apoptose comme la mort programmée d’une cellule.

On distingue chez l’homme deux grandes voies d’induction de l’apoptose d’une cellule cible :

  • La voie intrinsèquevoie mitochondriale, est permise par la libération (par la CTL) de granules renfermant des protéines pro-apoptotiques.
  • La voie extrinsèque: c’est un mécanisme indépendant de l’action des granules cytotoxiques qui met en jeux des récepteurs TNF.

L’apoptose est un phénomène déclenché par l’activation de cascades de caspases. Les caspases (ou aspartic-acid-specific cystein proteases) sont des enzymes : des cystéines protéase qui coupent après les résidus d’acide aspartique. On distingue 2 types de caspases : les caspases initiatrices (2, 8, 9, 10) qui activent les caspases effectrices (3, 6, 7). La caspase-3 joue un rôle moteur dans l’induction de l’apoptose car une fois activée, celle-ci clive les inhibiteurs des endonucléases et les molécules anti-apoptotiques. Elle active indirectement les endonucléases responsables de la fragmentation de l’ADN de la cellule cible. On cherche alors a décrire les mécanismes moléculaires mis en jeu pour activer la caspase-3 et donc induire l’apoptose de la cellule cible par le LTc.

La voie extrinsèque :

Il y a présence d’un récepteur du signal (émis par le récepteur de la CTL lors de la reconnaissance de la cellule cible) sur la membrane plasmique de la cellule cible : c’est le récepteur TNF (on distingue FAS, TNF-R1 et TRAIL). Il y a liaison d’un ligand (TNFα, FasL) sur la portion N-terminale du récepteur puis trimérisation du récepteur et activation. Une fois activé, il y a recrutement  par la portion C-terminale du récepteur d’un complexe DISC composé de molécules adaptatrices FADD et de procaspases initiatrices 8 et 10.

La molécule adaptatrice FADD possède 2 domaines d’interaction:

  • DD : death domain
  • DED : death effector domain qui interagit avec la procaspase-8. Celle-ci s’active et devient caspase-8.

222222222222222

(source: http://atctoxicologie.free.fr/archi/apoptose_Chmielewski.pdf)

Dans les cellules dites de  « type I », la caspase initiatrice active immédiatement une caspase effectrice. De ce fait, la caspase-8 autoclivée une fois activée par son interaction avec DED, permet l’activation de caspases effectrice 3, 6 et 7. Le déclenchement de l’apoptose est indépendant de la voie intrinsèque.

Par contre dans les cellules de « type II », la caspase initiatrice (caspase-8) clive la protéine BID, ce qui engendrera le  largage de facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie, et à  l’activation d’autres caspases et à l’induction de l’apoptose (voie intrinsèque ci-dessous).  Il y’a ici couplage de la voie intrinsèque et de la voie extrinsèque.

Récapitulatif de la voie intrinsèque: 

extrinseque OK

TNF : tumor necrosis factor

TNF-R1 : Tumor Necrosis Factor Receptor

TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand

FasL : FAS ligan

FADD : Fas-associated death domain

DISC : Death-Inducing Signaling Complex

FADD : Fas Associated Death Domain

NB : les granules cytotoxiques se composent aussi de  granulysine antimicrobienne et déclenche l’apoptose.

La voie Intrinsèque : Par les granzymes B

  • Reconnaissance par la CTL d’une cellule infectée du greffon

Le récepteur de la CTL reconnaît le peptide antigénique et le CMH allogénique. Si son affinité avec le complexe CMH I/peptide est suffisante, celui-ci va permettre au LTC de libérer par exocytose des granules cytotoxiques : ce sont des lysosomes modifiés contenant des protéines effectrices de la cytotoxicité, notamment :

  • La Perforine: glycoprotéine chargée du transfert du contenu des granules à travers la membrane, dans cytoplasme cellule cible
  • La Granzyme: c’est une serine protéase qui déclenche l’apoptose une fois dans le cytoplasme

Elles sont actives mais ne fonctionnent qu’une fois libérées.

  • Libération des granules 

La CTL va établir avec sa cellule cible une synapse immunologique particulière : la synapse lytique (qui dure quelques minutes). Le signal envoyé par l’interaction TCR/cellule cible dirige les granules par l’intermédiaire des microtubules (cytosquelette du LTC) et du MTOC. Les granules sont ensuite libérés dans la fente synaptique. On assiste à une libération des polarisée des protéines contenues dans les granules. Ils ne sont pas tous libérés, ce qui permet au LTC d’avoir plusieurs cibles.

MTOC : centre organisateur des microtubules

synapse lytique

(source: Parcours LMD, Immunologie, Eric ESPINOZA et Pascal CHILLET, 2010)

  • Programmation de la mort par fragmentation de l’ADN nucléaire de la cellule cible

On a longtemps pensé que la perforine établissait un pore dans la membrane qui laissait passer la granzyme mais NON,  elle est transférée sous forme de complexe multimérique (formé de plusieurs sous-unités ou monomères) sans apparition de pore. Granzyme et perforine forment un complexe avec le protéoglycan serglycine dans un granule. Une fois libéré, le contenu des granules cytotoxiques est livré sur la membrane de la cellule cible. Les perforines (sans faire de pores, mécanisme encore inconnu) dirigent le contenu des granules dans le cytosol cellule cible.

Structure de la granzyme B (3kb) :

granzyme B

source: « Crystal structure of human granzyme B » , http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1FQ3 

Granzyme B peut agir selon les mécanismes suivants :

  • Granzyme B clive et active les caspases initiatrices 8 et 10 qui à leur tour activent des caspases effectrices dont la caspase-3 (le clivage de la procaspase-3 donne une caspase-3 active).
  • Granzyme B clive BID qui devient tBID (BID tronqué) et agit sur la mitochondrie dans le but d’activer les caspases effectrices, notamment la caspase-3.

Modèles 3D: a gauche la protéine BID (Human pro-apoptotic protein BID) et a droite, tBID (NMR structures of human apoptotic protein tBid in LPPG micelle)

BID tBID

http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=2M5I&bionumber=1&jmolMode=HTML5)

Granzyme : sérine protéase

BID : Protéine (BH3 Interacting domain death agonist protein), membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2

 

 

Comment tBID intervient-elle dans l’activation de caspases effectrices?

La membrane de la mitochondrie comporte une famille de protéines, la famille Bcl-2. Dans cette famille on distingue :

  • Des protéines ayant une activité pro-apoptotique : BAX et BAK
  • D’autres ont une activité anti-apoptotique : membres de Bcl-2 et Bcl-XL / McL-1. Ceux-ci forment des hétérodimères avec BAX et BAK et par conséquent stabilisent la mitochondrie.

On suppose que les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 agiraient :

  • En prévenant la perforation de la membrane mitochondriale
  • En bloquant la formation de pores
  • En stabilisant la couche lipidique de la membrane externe

Les protéines ce cette famille Bcl-2 possèdent des séquences homologues dans leur domaine BH3.

La protéine BID possède aussi un domaine BH3 unique, c’est ainsi qu’il y’aura interaction via le domaine BH3 entre tBID et le dimère BAX/BAD.

La transmission de message se fait par BAX (localisé dans le cytosol de la mitochondrie) : un stress apoptotique est provoqué par tBID (tBID agit sur le dimère BAX/BAK  de la mitochondrie: Il fait changer de conformation l’extrémité c-terminale de BAX et il y a perte d’interaction entre BAX, BAK et les protéines anti apoptotiques).  Par la suite, la protéine BAX s’accroche à la membrane externe de la mitochondrie. Ceci engendre une perforation de celle-ci qui devient perméable aux protéines. La perméabilisation  de la membrane permet à la mitochondrie de libérer des molécules pro-apoptotiques, notamment le cytochrome c dans le cytosol de la cellule.

 

Action du Cytochrome c :

Il contribue à la cascade de caspases  et à la formation de l’apoptosome.

Apoptosome =  cytochrome c +  protéine Apaf-1

Modèle 3D de l’apoptosome: 

(Source: Yuan et al. 2010, Structure of an apoptosome-procaspase-9 CARD complex )

Le cytochrome c  se lie avec la protéine Apaf-1 (Apoptosis Protease-Activiting Factor-1) en présence d’ATP.

Visualisation du cytochome c :

cyto C

(Source: redox conformation changes in refined tuna cytochrome c, http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=3CYT&bionumber=1&jmolMode=HTML5)

Il y a ensuite liaison de l’apoptosome avec des procaspases 9 initiatrices. Ce qui engendre l’activation de caspases effectrices 3, 6 et 7.

L'apoptosome

(source: http://www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/apoptosis/caspases.htm)

Récapitulatif sur la voie intrinsèque: 

intrinsèque

A noter : la procaspase-9 a plus dʼaffinité pour lʼapoptosome que la caspase-9 active ce qui permet une rotation/activation des caspases-9 au sein d’un même apoptosome.

 

Combinaisons des différentes voies d’activation de la caspase 3 et donc d’induction de l’apoptose de la cellule cible: 

apopp finl

NB: Caspases 3 et 7 interviennent dans l’induction de l’apoptose mais la caspase 7 a un rôle minime. On retient donc le rôle de la caspase 3.

 

Une fois la caspase-3 activée (par voie intrinsèque ou extrinsèque) :

La caspase-3 activée va cliver l’ICAD. L’ICAD clivé se lie à CAD inactive ce qui engendre l’activation de CAD.

CAD est une enzyme nucléase qui dégrade l’ADN cellule cible : celui-ci subit une fragmentation en fragments de 200 paires de bases. Le clivage se fait  entre les nucléosomes.

Action de CAD:

ICAD

(Source: http://www.rcdrg.sgul.ac.uk/research/cell-apoptosis/caspase-activation)

casp 3

ICAD : protéine inhibitrice

CAD : caspase activated desoxyribonuclease

L’apoptose peut aussi être déclenchée par l’intermédiaire des granzymes A : La granzyme A agit indépendamment des caspases et cible le complexe protéolytique associé au réticulum endoplasmique de la cellule cible. Celui-ci active la DNase qui va fragmenter l’ADN. DNase : Enzyme chargée de fragmenter l’ADN de la cellule cible.

 

Schéma récapitulatif des différents modes d’induction de l’apoptose par une CTL:

BCB2C3_apoptose_general

(source: http://biotech-btk.wifeo.com/apoptose.php)

Remarque: ce schéma laisse penser que la membrane de la cellule cible est perforée par la perforine, ce qui n’est, comme nous l’avons précisé précédemment, pas le cas. Des études récentes ont montré que la perforine permet aux granzymes d’entrer dans le cytosol de la cellule cible sans faire de pore dans sa membrane mais les mécanismes sont encore inconnus.

 

Migration vers une nouvelle cible (les CTL peuvent être recyclée pour tuer plusieurs cibles)

En effet, les CTL possèdent un grand nombre de granules qui ne sont pas tous libérés pour une cellule cible. Ceci permet donc à la CTL d’voir plusieur cellules cibles.

 

Mort de la cellule cible par apoptose

La CTL après avoir libéré des granules cytotoxiques dns une cellule cible, migre vers une autre cible. Pendant ce temps, la cellule précédente meurt par apoptose.

Durant l’apoptose de la cellule cible on observe de la chromatine condensée au début, elle s’accole à l’enveloppe nucléaire. Par la suite, le noyau et le cytoplasme se condensent, le noyau se déforme et l’ADN se fragmente (par les mécanismes cités précédemment).  Le noyau est très condensé vers la fin de l’apoptose. La cellule se détruit elle-même de l’intérieur, on observe:

  • une perte de vésicules membranaires
  • la mitochondrie n’est plus visible
  • Une ouverture des vésicules de la cellule qui provoque la perte de cytoplasme et de membrane.

Les caspases effectrices ont aussi un impact moléculaire sur le cytosquelette de la cellule cible (des protéines des jonctions adhérentes, comme la β-caténine qui assure les interactions entre cellules, sont aussi dégradées), des protéines nucléaires (la dégradation de la lamine nucléaire par le caspase 6 entraine une dégradation de la membrane nucléaire par exemple), ou encore les protéines anti-apoptotiques citées précédemment.

apoptose microscope

(source: http://lycee.nicolas-cohen.org/index.php/ressources/images-et-photos)

Petit plus: Pour voir des animations sur la cytotoxicité des cellules T nous vous renvoyons sur le lien suivant:

http://biotechnologies.ac-creteil.fr/IMG/swf/immunite_cellulaire.swf

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